UOC Immunologia e diagnostica molecolare oncologica

La progressione e la crescita dei tumori presuppongono la necessità che i tumori stessi sviluppino una rete vascolare in grado di fornire nutrimento ed ossigenazione alle cellule neoplastiche. Tale fenomeno, conosciuto come “neoangiogenesi tumorale”, ha suscitato nell’ultimo decennio notevole interesse, anche alla luce del fatto che la neoangiogenesi può rappresentare un significativo bersaglio nell’immunoterapia dei tumori. Il concetto alla base di questa forma di terapia è apparentemente molto semplice: se ogni tumore per accrescersi ha bisogno di nutrienti che gli vengono forniti mediante i vasi sanguigni che lo circondano, riducendo tale apporto si potrebbe verosimilmente ritardare o addirittura bloccare la crescita neoplastica. Gli inibitori dell’angiogenesi dovrebbero comunque essere somministrati ai pazienti per tempi prolungati al fine di ottenere un effetto terapeutico duraturo: da qui l’idea di utilizzare vettori retrovirali e lentivirali per trasferire i rispettivi geni, in modo tale che siano le cellule stesse dell’ospite a produrre fattori in grado di ostacolare la vascolarizzazione del tumore. L’approccio che si è scelto è stato quindi quello della terapia genica, ovvero la possibilità di curare una determinata patologia neoplastica mediante il trasferimento nel malato di opportuni geni terapeutici. Le ricerche in questa direzione sono per ora limitate esclusivamente a modelli animali, ai topi in particolare; è tuttavia evidente la speranza di poterne trasferire le acquisizioni anche in ambito umano in tempi medio/lunghi. Uno dei progetti in corso è rivolto ad approfondire alcune strategie terapeutiche innovative per contrastare il fenomeno della neoangiogenesi nei tumori della mammella e dell’ovaio. Lo studio ha finora permesso di verificare l’attività terapeutica di alcune molecole appartenenti alla classe degli inibitori dell’angiogenesi tumorale e comprendenti angiostatina, endostatina ed interferone-alfa. Questa strategia dovrebbe consentire di ridurre i costi di queste terapie innovative e possibilmente limitare l’incidenza e l’intensità degli effetti collaterali, a vantaggio dei pazienti.

L’immunologia dei tumori ha conosciuto negli ultimi 30 anni alterne fortune, legate essenzialmente alla difficoltà di evocare risposte immunitarie efficaci contro i tumori. Le neoplasie infatti possono esprimere antigeni specifici, la cui immunogenicità è peraltro relativamente scarsa. Accanto a questo problema, le cellule neoplastiche si avvalgono di numerose strategie per sfuggire al controllo del sistema immunitario, tra cui il mascheramento degli antigeni tumorali o il rilascio di fattori con funzione immunosoppressoria. Ciononostante, moltissimi gruppi sono impegnati nel mondo con l’obiettivo di mettere a punto nuovi vaccini anti-tumorali che sfruttano la moderna tecnologia del DNA ricombinante, a cui si affiancano strategie innovative di valutazione della risposta immunitaria cellulo-mediata. Nei nostri laboratori sono allo studio modelli di tumori sperimentali che prevedono l’impiego di ceppi murini convenzionali e transgenici, in cui viene valutata l’efficacia preventiva e/o terapeutica di nuove formulazioni vaccinali che fanno uso di costrutti plasmidici a DNA, costrutti virali ricombinanti, cellule dendritiche. La valutazione dell’efficacia della vaccinazione viene condotta mediante un monitoraggio multiparametrico che prevede l’impiego di saggi ELISA, di tetrameri in citofluorimetria, nonché l’allestimento di colture cellulari. A questa ricerca si sono affiancati progressivamente studi condotti su pazienti portatori di tumore: ad esempio, viene condotto uno studio che prevede la valutazione nel sangue periferico e nella massa tumorale dell’assetto immunologico di pazienti con melanoma, alcuni dei quali sottoposti a vaccinazione con peptidi. In questo ambito, il gruppo di ricerca ha partecipato ad un trial clinico di fase I/II per la vaccinazione con peptidi di antigeni tumorali di pazienti con melanoma avanzato, coordinato dall’Istituto Pasteur (Parigi).

Tra le strategie che i tumori adottano per sfuggire al controllo del sistema immunitario dell’ospite vi è la capacità delle cellule tumorali di indurre nel paziente uno stato di immunodepressione, talora molto pronunciato. Nei pazienti con patologia neoplastica l’abilità del sistema immune di rilevare e distruggere le cellule tumorali può quindi essere notevolmente compromessa, e questo deficit può rappresentare una delle cause alla base dello scarso successo dei protocolli clinici di immunoterapia attiva condotti su pazienti portatori di tumori solidi. Studi condotti in modelli preclinici e in patologie neoplastiche umane hanno dimostrato che cellule dello stipite monocitario-macrofagico svolgono un ruolo determinante nel condizionare la risposta immunitaria anti-tumorale. Il nostro progetto si propone di caratterizzare, fenotipicamente e funzionalmente, le cellule mieloidi soppressorie (MSC) isolate dagli organi linfoidi secondari e dalla massa tumorale, al fine di individuare marcatori specifici di questa popolazione cellulare e definire vie biochimiche coinvolte nell’attività soppressoria che tali cellule esercitano nei confronti dei linfociti T tumore-specifici. E’ in corso anche una comparazione del profilo trascrizionale di MSC in diverse situazioni funzionali e/o ottenute da distretti anatomici differenti. Sulla base dei dati ottenuti sino ad ora è possibile affermare che le MSC impiegano enzimi chiave del metabolismo dell’aminoacido arginina, quali arginasi (Arg) e ossido nitrico sintetasi (NOS), per determinare nei linfociti T attivati dall’antigene uno stato di paralisi funzionale.

Questa prima conclusione ci permette di delineare nuove strategie farmacologiche, in grado di neutralizzare in vivo l’azione delle cellule soppressorie, il cui impiego possa potenziare l’efficacia terapeutica di protocolli di vaccinazione anti tumorale. In previsione di un trasferimento clinico a breve termine di queste ricerche, abbiamo recentemente identificato in collaborazione con una ditta italo-francese (Nicox S.A.), alcuni composti donatori di NO derivati dall’acido acetilsalicilico (nitroaspirine) la cui somministrazione per via orale in topi con tumore annulla gli effetti soppressori delle MSC e ripristina la risposta antitumorale indotta dalla vaccinazione.

La linfomagenesi è fenomeno complesso, probabilmente a più tappe, nel corso del quale entrano in gioco caratteristiche inerenti la cellula tumorale e fattori diversi propri dell’ospite, tra i quali soprattutto quelli immunitari. Studi epidemiologici condotti negli ultimi anni hanno evidenziato un’incidenza di linfomi di tipo B non-Hodgkin nei soggetti immunodepressi da 20 a 50 volte superiore rispetto alla popolazione normale. Il dato è rilevante, se consideriamo il numero crescente di pazienti trapiantati in profilassi immunosoppressiva o di pazienti sieropositivi per HIV, tuttavia i meccanismi che contribuiscono allo sviluppo di queste patologie linfoproliferative non sono ancora completamente chiariti, soprattutto per quanto riguarda il ruolo giocato da fattori T (immunodeficienza) e B linfocitari (stimolazione antigenica cronica). Con l’obiettivo di contribuire alla comprensione di questi aspetti, il nostro gruppo di lavoro nell’arco degli ultimi vent’anni ha sviluppato lo studio della genesi delle patologie immunoproliferative B lungo due direttive principali:

• lo studio delle alterazioni del compartimento linfocitario B sottoposto ad una stimolazione antigenica cronica in presenza di una drastica riduzione del linfociti T CD4, qual è l’infezione da HIV;
• lo studio del modello del topo SCID, affetto da immunodeficienza grave combinata, nel quale si sviluppano, a seguito dell’inoculo di PBMC da donatori EBV+, linfomi umani con caratteristiche simili ai linfomi immunoblastici dell’ospite immunocompromesso.

Per quanto riguarda il primo ambito di studio, nel corso degli anni è stato possibile dimostrare che l’attivazione dei linfociti B in corso d’infezione da HIV è per lo più diretta verso determinanti antigenici virali, al punto che in alcuni pazienti sono evidenziabili bande sieriche oligoclonali HIV-specifiche; che la presenza in circolo di precursori B attivati HIV-specifici è IL-6 dipendente e che tali precursori sono refrattari alla stimolazione con mitogeni il che può riflettere un deficit della memoria immunitaria B; che tale disregolazione B contribuisce ad amplificare il danno direttamente prodotto da HIV sui linfociti T e può almeno in parte essere utilmente contrastata da un’efficace terapia anti-virale. Infine, più di recente, siamo stati in grado di mettere in relazione l’intensità dell’attivazione del compartimento B a livello linfonodale con la quantità di virioni adesi alle cellule follicolari dendritiche.
Per quanto riguarda il modello del topo SCID, il nostro gruppo ha approfondito il ruolo giocato dai linfociti T nello sviluppo dei linfomi umani EBV+. Gli studi condotti hanno consentito di dimostrare che la presenza di linfociti T nell’inoculo cellulare è necessaria per lo sviluppo di linfoma, tant’è che il trattamento dei PBMC con ciclosporina A contrasta la formazione del tumore e che le masse originano dai pochi linfociti B latentemente infettati con EBV presenti nell’inoculo, i quali vanno incontro ad una notevole espansione in seguito al massiccio rilascio di citochine/chemochine da parte dei linfociti T (sia CD4+ che CD8+) attivati nel microambiente murino. Questi risultati, uniti alle osservazioni sulla localizzazione dei tumori hu/SCID (masse addominali, spesso infiltranti e conglobanti le anse intestinali e l’ilo epatico, con metastasi prevalentemente epatiche e peritoneali), hanno dato impulso agli studi più recenti, volti ad approfondire l’importanza dell’asse CXCL12 (principale chemochina prodotta dalle cellule mesoteliali)/CXCR4 nella linfomagenesi di questo modello sperimentale.

L’analisi del profilo d’espressione delle chemochine più importanti per la biologia della linfomagenesi EBV-associata ha consentito di documentare che il recettore CXCR4 è il recettore maggiormente espresso nei tumori hu/SCID e in numerose linee linfoblastoidi B (LCL) generate in vitro, le quali esprimono sia a livello di messaggero (RT-PCR) che di proteina (analisi citofluorimetrica) anche il ligando di CXCR4, CXCL12 suggerendo un possibile circuito autocrino. Il blocco dell’asse CXCR4/CXCL12 con un anticorpo neutralizzante anti-CXCL12 o con un antagonista di CXCR4, TC14012, si è dimostrato capace di contrastare la crescita tumorale nel modello animale. Poiché CXCR4 è espresso nella controparte umana dei linfomi hu/SCID queste osservazioni potrebbero aprire la via a nuovi approcci terapeutici dei linfomi B non-Hodgkin nell’uomo.

Il continuo aumento delle conoscenze dei complessi pathway molecolari coinvolti nel cancro sta fornendo alla ricerca traslazionale sempre maggiori possibilità in ambito diagnostico e prognostico. Le lesioni molecolari diventano quindi dei marcatori di neoplasia utili nella pratica clinica.

• Una recente linea di ricerca riguarda l’analisi di alterazioni cromosomiche (la delezione di una specifica regione a livello del braccio corto del cromosoma 1 (1p36) e del braccio lungo del cromosoma 19 (19q13) negli oligodendrogliomi, alterazioni che individuano un gruppo di pazienti responsivi alla chemioterapia con miglior prognosi.
• Lo studio della metilazione del promotore del gene MGMT può essere invece utilizzato per identificare quei pazienti che, presentando una ridotta espressione del gene e quindi un basso livello enzimatico, sono in grado di rispondere in maniera più efficace al trattamento con agenti alchilanti, come nitrosuree e temozolomide, che rappresentano, al momento attuale, i principali farmaci utilizzati nel trattamento dei tumori cerebrali. Lo studio prevede quindi sia la valutazione del significato prognostico di questo marcatore sia il suo utilizzo quale parametro predittivo di risposta alla terapia.
• In oltre il 90% dei casi di HNPCC (carcinoma colorettale ereditario non poliposico) si riscontra una particolare forma di alterazione molecolare, l’instabilità dei microsatelliti, che può quindi rappresentare un utile marker per identificare famiglie HNPCC. Nell’ambito di un progetto volto alla formazione di un gruppo interdisciplinare per la standardizzazione dell’iter diagnostico-terapeutico e il follow-up dei pazienti con carcinoma del colon-retto ereditario, viene condotta l’analisi dei microsatelliti con l’obiettivo di individuare dei criteri di selezione dei pazienti, da sottoporre al test di screening, che devono tener conto delle caratteristiche e delle peculiarità della popolazione locale ed indirizzare i pazienti all’analisi mutazionale dei 2 geni (MSH2 e MLH1) più frequentemente alterati.
• Piu’ di recente e’ stata iniziata una linea di ricerca mirata a studiare il ruolo della proteina oncosoppressoria Menin in neoplasie pancreatiche ed ipofisarie. Gli studi finora condotti hanno portato alla definizione del pattern di espressione “in situ” di questa proteina nelle diverse popolazioni cellulari di pancreas ed ipofisi e nelle neoplasie da esse derivate. Questi studi sono basati su metodiche d microscopia confocale per l’analisi dell’espressione della proteina in tessuti criopreservati e di metodiche molecolari per l’analisi delle alterazioni genetiche ed epigenetiche del gene MEN 1 che codifica per Menin.
• Nell’ambito delle neoplasie ematologiche l’analisi citogenetica e molecolare permettono di approfondire il significato di alterazioni genetiche nuove quali futuri marcatori prognostici e di risposta alla terapia.

L’attivita’ di ricerca e’ incentrata sull’analisi dei meccanismi molecolari che controllano l’espressione e la replicazione del retrovirus leucemogeno umano HTLV-1. Questi studi hanno portato alla scoperta di nuovi geni espressi da HTLV-1 attraverso splicing alternativo. Successivamente, gli studi sono stati diretti alla ricerca del meccanismo di azione delle proteine codificate da questi geni. Questi studi hanno condotto all’analisi delle interazioni fra proteine virali e processi cellulari preposti al controllo del trasporto nucleocitoplasmatico di macromolecole. Inoltre, gli studi sulla proteina p13II di HTLV-1 hanno rivelato che questa si localizza elettivamente a livello mitocondriale e modifica la struttura e la funzione di questi organelli. Questi ultimi risultati hanno dato origine ad un filone di ricerca, attualmente in corso, volto a definire il ruolo delle funzioni mitocondriali nella strategia di replicazione di HTLV-1, delle sue proprieta’ patogenetiche e, piu’ in generale, dei processi di trasformazione neoplastica.

L’apoptosi, o morte cellulare programmata, è un processo fisiologico di autodistruzione cellulare; gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo, nel mantenimento dell’omeostasi tissutale, nella difesa dagli agenti patogeni e nella maturazione del sistema immunitario. L’alterazione di questo processo è implicato nella patogenesi del cancro, di patologie autoimmuni e malattie neurodegenerative. Poiché l’infezione con HTLV-1 è correlata sia all’insorgenza di neoplasie altamente refrattarie alla chemioterapia, che di malattie neurodegenerative, il nostro progetto attuale si propone di verificare il ruolo della proteina Tax di HTLV-1 nel processo apottotico. I primi risultati indicano che la proteina Tax svolge un ruolo differenziale a seconda del programma apoptotico attivato. Tax non è in grado di inibire pathway attivati da stimoli recettoriali (TNF alfa), mentre proteggere da stimoli quali la deplezione di fattori di crescita o una elevata espressione della proteina pro-apoptotica Bax. Tale protezione sembra essere dovuta ad un blocco del pathway apoptotico mitocondriale poiché cellule Tax-positive presentano inibizione sia al rilascio del citocromo c dai mitocondri che alla traslocazione di Bax dal citosol ai mitocondri, due fenomeni strettamente correlati all’attivazione della via apoptotica mitocondriale. L’uso di alcuni mutanti ci ha inoltre permesso di determinare l’importanza della attivazione della via CREB nella protezione dall’apoptosi mediata da Tax. Questo ultimo dato risulta interessante in quanto recentemente è stata riportata la rilevanza della via CREB nello sviluppo di alcune neoplasie ematopoietiche.

I papillomavirus umani sono eziologicamente associati al carcinoma della cervice uterina e in misura minore ai carcinomi di vulva, vagina, ano e pene. La persistenza dell’infezione con alcuni fra i più di 100 diversi tipi di HPV (e in particolar modo il tipo 16) rappresenta il fattore di maggior rischio di sviluppo del carcinoma cervicale. Solo una piccola parte delle donne con infezione persistente sviluppa lesioni displastiche gravi, poiché altri fattori virali (quali la carica virale e la presenza di varianti virali) e fattori legati all’ospite (quali la compromissione del sistema immunitario e il fumo) influenzano la storia naturale dell’infezione da HPV. Inoltre, la stretta associazione causale fra HPV e carcinoma cervicale rappresenta il presupposto sia per una prevenzione primaria mediante l’utilizzo di vaccini che prevengono l’infezione, che per il possibile utilizzo di test per la ricerca di HPV al fine di aumentare l’efficacia della prevenzione secondaria. Gli studi svolti ed in corso presso la nostra Unità sui papillomavirus umani riguardano la ricerca, tipizzazione e caratterizzazione (quantitativa e mutazionale) degli HPV in carcinomi e lesioni pre-neoplastiche cervico-vaginali e ano-genitali; quelli più significativi sono:

• uno studio prospettico (iniziato nel 1995) di donne immunodepresse per infezione da virus dell’immunodeficienza;
• uno studio prospettico di donne immunocompetenti e immunodepresse con infezione da HPV tipo 16;
• uno studio multicentrico randomizzato sull’utilizzo di un test HPV nello screening del cervico-carcinoma.

Il 5-10% circa di tutti i tumori si sviluppano in soggetti geneticamente predisposti appartenenti a famiglie nelle quali la predisposizione all’insorgenza della malattia viene trasmessa come un carattere mendeliano semplice, spesso ad alta penetranza. Nel corso degli ultimi 10 anni le ricerche condotte dal nostro gruppo si sono focalizzate sullo studio delle basi genetiche dei tumori ereditari con particolare riferimento ai carcinomi mammario ed ovarico e, più recentemente, al melanoma cutaneo maligno. Mutazioni a carico dei geni BRCA1 e BRCA2 sono responsabili di buona parte dei carcinomi mammari ed ovarici ad eziologia eredo-familiare; similmente, alterazioni geniche dei geni CDKN2A e CDK4 rendono conto di parte dei melanomi cutanei maligni che insorgono in individui geneticamente predisposti. In collaborazione con i reparti dell’Oncologia Medica, Clinica Chirurgica II e Senologia dell’Azienda Ospedaliera di Padova, l’Unità e’ attivamente coinvolta in uno studio multidisciplinare teso all’identificazione, reclutamento e sorveglianza di famiglie ad alto rischio.
I principali temi, oggetto delle ricerche attualmente condotte nel nostro laboratorio, possono essere riassunti nei seguenti punti:

• Analisi mutazionale dei geni BRCA1, BRCA2, CDKN2A e studio delle correlazioni genotipo/fenotipo.
• Messa a punto di strategie di screening mutazionale di II generazione in grado di identificare alterazioni genetiche non convenzionali.
• Caratterizzazione della rilevanza biologica di varianti geniche a significato patogenetico ignoto.
• Identificazione di geni/alleli a bassa penetranza e studio della loro potenziale azione modulatrice nei confronti di mutazioni nei geni ad alta penetranza.