UOC Immunologia e diagnostica molecolare oncologica

La progressione e la crescita dei tumori presuppongono la necessità che i tumori stessi sviluppino una rete vascolare in grado di fornire nutrimento ed ossigenazione alle cellule neoplastiche. Tale fenomeno, conosciuto come “neoangiogenesi tumorale”, ha suscitato nell’ultimo decennio notevole interesse, anche alla luce del fatto che la neoangiogenesi può rappresentare un significativo bersaglio nell’immunoterapia dei tumori. Il concetto alla base di questa forma di terapia è apparentemente molto semplice: se ogni tumore per accrescersi ha bisogno di nutrienti che gli vengono forniti mediante i vasi sanguigni che lo circondano, riducendo tale apporto si potrebbe verosimilmente ritardare o addirittura bloccare la crescita neoplastica.

Gli inibitori dell’angiogenesi dovrebbero comunque essere somministrati ai pazienti per tempi prolungati al fine di ottenere un effetto terapeutico duraturo: da qui l’idea di utilizzare vettori retrovirali e lentivirali per trasferire i rispettivi geni, in modo tale che siano le cellule stesse dell’ospite a produrre fattori in grado di ostacolare la vascolarizzazione del tumore. L’approccio che si è scelto è stato quindi quello della terapia genica, ovvero la possibilità di curare una determinata patologia neoplastica mediante il trasferimento nel malato di opportuni geni terapeutici.

Le ricerche in questa direzione sono per ora limitate esclusivamente a modelli animali, ai topi in particolare; è tuttavia evidente la speranza di poterne trasferire le acquisizioni anche in ambito umano in tempi medio/lunghi. Uno dei progetti in corso è rivolto ad approfondire alcune strategie terapeutiche innovative per contrastare il fenomeno della neoangiogenesi nei tumori della mammella e dell’ovaio. Lo studio ha finora permesso di verificare l’attività terapeutica di alcune molecole appartenenti alla classe degli inibitori dell’angiogenesi tumorale e comprendenti angiostatina, endostatina ed interferone-alfa. Questa strategia dovrebbe consentire di ridurre i costi di queste terapie innovative e possibilmente limitare l’incidenza e l’intensità degli effetti collaterali, a vantaggio dei pazienti.

L’immunologia dei tumori ha conosciuto negli ultimi 30 anni alterne fortune, legate essenzialmente alla difficoltà di evocare risposte immunitarie efficaci contro i tumori. Le neoplasie infatti possono esprimere antigeni specifici, la cui immunogenicità è peraltro relativamente scarsa.

Accanto a questo problema, le cellule neoplastiche si avvalgono di numerose strategie per sfuggire al controllo del sistema immunitario, tra cui il mascheramento degli antigeni tumorali o il rilascio di fattori con funzione immunosoppressoria. Ciononostante, moltissimi gruppi sono impegnati nel mondo con l’obiettivo di mettere a punto nuovi vaccini anti-tumorali che sfruttano la moderna tecnologia del DNA ricombinante, a cui si affiancano strategie innovative di valutazione della risposta immunitaria cellulo-mediata.

Nei nostri laboratori sono allo studio modelli di tumori sperimentali che prevedono l’impiego di ceppi murini convenzionali e transgenici, in cui viene valutata l’efficacia preventiva e/o terapeutica di nuove formulazioni vaccinali che fanno uso di costrutti plasmidici a DNA, costrutti virali ricombinanti, cellule dendritiche.

La valutazione dell’efficacia della vaccinazione viene condotta mediante un monitoraggio multiparametrico che prevede l’impiego di saggi ELISA, di tetrameri in citofluorimetria, nonché l’allestimento di colture cellulari. A questa ricerca si sono affiancati progressivamente studi condotti su pazienti portatori di tumore: ad esempio, viene condotto uno studio che prevede la valutazione nel sangue periferico e nella massa tumorale dell’assetto immunologico di pazienti con melanoma, alcuni dei quali sottoposti a vaccinazione con peptidi.

In questo ambito, il gruppo di ricerca ha partecipato ad un trial clinico di fase I/II per la vaccinazione con peptidi di antigeni tumorali di pazienti con melanoma avanzato, coordinato dall’Istituto Pasteur (Parigi).

Tra le strategie che i tumori adottano per sfuggire al controllo del sistema immunitario dell’ospite vi è la capacità delle cellule tumorali di indurre nel paziente uno stato di immunodepressione, talora molto pronunciato. Nei pazienti con patologia neoplastica l’abilità del sistema immune di rilevare e distruggere le cellule tumorali può quindi essere notevolmente compromessa, e questo deficit può rappresentare una delle cause alla base dello scarso successo dei protocolli clinici di immunoterapia attiva condotti su pazienti portatori di tumori solidi.

Studi condotti in modelli preclinici e in patologie neoplastiche umane hanno dimostrato che cellule dello stipite monocitario-macrofagico svolgono un ruolo determinante nel condizionare la risposta immunitaria anti-tumorale. Il nostro progetto si propone di caratterizzare, fenotipicamente e funzionalmente, le cellule mieloidi soppressorie (MSC) isolate dagli organi linfoidi secondari e dalla massa tumorale, al fine di individuare marcatori specifici di questa popolazione cellulare e definire vie biochimiche coinvolte nell’attività soppressoria che tali cellule esercitano nei confronti dei linfociti T tumore-specifici.

È in corso anche una comparazione del profilo trascrizionale di MSC in diverse situazioni funzionali e/o ottenute da distretti anatomici differenti. Sulla base dei dati ottenuti sino ad ora è possibile affermare che le MSC impiegano enzimi chiave del metabolismo dell’aminoacido arginina, quali arginasi (Arg) e ossido nitrico sintetasi (NOS), per determinare nei linfociti T attivati dall’antigene uno stato di paralisi funzionale.

Questa prima conclusione ci permette di delineare nuove strategie farmacologiche, in grado di neutralizzare in vivo l’azione delle cellule soppressorie, il cui impiego possa potenziare l’efficacia terapeutica di protocolli di vaccinazione anti tumorale. In previsione di un trasferimento clinico a breve termine di queste ricerche, abbiamo recentemente identificato in collaborazione con una ditta italo-francese (Nicox S.A.), alcuni composti donatori di NO derivati dall’acido acetilsalicilico (nitroaspirine) la cui somministrazione per via orale in topi con tumore annulla gli effetti soppressori delle MSC e ripristina la risposta antitumorale indotta dalla vaccinazione.

La linfomagenesi è fenomeno complesso, probabilmente a più tappe, nel corso del quale entrano in gioco caratteristiche inerenti la cellula tumorale e fattori diversi propri dell’ospite, tra i quali soprattutto quelli immunitari. Studi epidemiologici condotti negli ultimi anni hanno evidenziato un’incidenza di linfomi di tipo B non-Hodgkin nei soggetti immunodepressi da 20 a 50 volte superiore rispetto alla popolazione normale. Il dato è rilevante, se consideriamo il numero crescente di pazienti trapiantati in profilassi immunosoppressiva o di pazienti sieropositivi per HIV, tuttavia i meccanismi che contribuiscono allo sviluppo di queste patologie linfoproliferative non sono ancora completamente chiariti, soprattutto per quanto riguarda il ruolo giocato da fattori T (immunodeficienza) e B linfocitari (stimolazione antigenica cronica). Con l’obiettivo di contribuire alla comprensione di questi aspetti, il nostro gruppo di lavoro nell’arco degli ultimi vent’anni ha sviluppato lo studio della genesi delle patologie immunoproliferative B lungo due direttive principali:

• • lo studio delle alterazioni del compartimento linfocitario B sottoposto ad una stimolazione antigenica cronica in presenza di una drastica riduzione del linfociti T CD4, qual è l’infezione da HIV;
  • lo studio del modello del topo SCID, affetto da immunodeficienza grave combinata, nel quale si sviluppano, a seguito dell’inoculo di PBMC da donatori EBV+, linfomi umani con caratteristiche simili ai linfomi immunoblastici dell’ospite immunocompromesso.

Per quanto riguarda il primo ambito di studio, nel corso degli anni è stato possibile dimostrare che l’attivazione dei linfociti B in corso d’infezione da HIV è per lo più diretta verso determinanti antigenici virali, al punto che in alcuni pazienti sono evidenziabili bande sieriche oligoclonali HIV-specifiche; che la presenza in circolo di precursori B attivati HIV-specifici è IL-6 dipendente e che tali precursori sono refrattari alla stimolazione con mitogeni il che può riflettere un deficit della memoria immunitaria B; che tale disregolazione B contribuisce ad amplificare il danno direttamente prodotto da HIV sui linfociti T e può almeno in parte essere utilmente contrastata da un’efficace terapia anti-virale. Infine, più di recente, siamo stati in grado di mettere in relazione l’intensità dell’attivazione del compartimento B a livello linfonodale con la quantità di virioni adesi alle cellule follicolari dendritiche. Per quanto riguarda il modello del topo SCID, il nostro gruppo ha approfondito il ruolo giocato dai linfociti T nello sviluppo dei linfomi umani EBV+. Gli studi condotti hanno consentito di dimostrare che la presenza di linfociti T nell’inoculo cellulare è necessaria per lo sviluppo di linfoma, tant’è che il trattamento dei PBMC con ciclosporina A contrasta la formazione del tumore e che le masse originano dai pochi linfociti B latentemente infettati con EBV presenti nell’inoculo, i quali vanno incontro ad una notevole espansione in seguito al massiccio rilascio di citochine/chemochine da parte dei linfociti T (sia CD4+ che CD8+) attivati nel microambiente murino. Questi risultati, uniti alle osservazioni sulla localizzazione dei tumori hu/SCID (masse addominali, spesso infiltranti e conglobanti le anse intestinali e l’ilo epatico, con metastasi prevalentemente epatiche e peritoneali), hanno dato impulso agli studi più recenti, volti ad approfondire l’importanza dell’asse CXCL12 (principale chemochina prodotta dalle cellule mesoteliali)/CXCR4 nella linfomagenesi di questo modello sperimentale.

L’analisi del profilo d’espressione delle chemochine più importanti per la biologia della linfomagenesi EBV-associata ha consentito di documentare che il recettore CXCR4 è il recettore maggiormente espresso nei tumori hu/SCID e in numerose linee linfoblastoidi B (LCL) generate in vitro, le quali esprimono sia a livello di messaggero (RT-PCR) che di proteina (analisi citofluorimetrica) anche il ligando di CXCR4, CXCL12 suggerendo un possibile circuito autocrino. Il blocco dell’asse CXCR4/CXCL12 con un anticorpo neutralizzante anti-CXCL12 o con un antagonista di CXCR4, TC14012, si è dimostrato capace di contrastare la crescita tumorale nel modello animale. Poiché CXCR4 è espresso nella controparte umana dei linfomi hu/SCID queste osservazioni potrebbero aprire la via a nuovi approcci terapeutici dei linfomi B non-Hodgkin nell’uomo.

L’attività di ricerca è incentrata sull’analisi dei meccanismi molecolari che controllano l’espressione e la replicazione del retrovirus leucemogeno umano HTLV-1. Questi studi hanno portato alla scoperta di nuovi geni espressi da HTLV-1 attraverso splicing alternativo. Successivamente, gli studi sono stati diretti alla ricerca del meccanismo di azione delle proteine codificate da questi geni. Questi studi hanno condotto all’analisi delle interazioni fra proteine virali e processi cellulari preposti al controllo del trasporto nucleocitoplasmatico di macromolecole. Inoltre, gli studi sulla proteina p13II di HTLV-1 hanno rivelato che questa si localizza elettivamente a livello mitocondriale e modifica la struttura e la funzione di questi organelli. Questi ultimi risultati hanno dato origine ad un filone di ricerca, attualmente in corso, volto a definire il ruolo delle funzioni mitocondriali nella strategia di replicazione di HTLV-1, delle sue proprietà patogenetiche e, più in generale, dei processi di trasformazione neoplastica.